Учебный портал Web-local web-local

Дисциплина " Токсикологическая химия "


Учебные материалы по дисциплине от ведущих преподавателей::

Семинары

 

Валидационные характеристики методов анализа, применяемых в токсикологической химии. Статистическая обработка результатов количественного анализа биоматериалов и вещественных доказательств.
 
Структура занятия:                                                 
I.      Входной тест
II. Лабораторно-практическое занятие «Статистическая обработка результатов количественного анализа биоматериалов и вещественных доказательств».
 
Целевые задачи:
-        изучить показатели валидации аналитических методов;
-        закрепить знания по статистической обработке результатов анализа при решении химико-токсикологических и судебно-химических задач.
 
Краткое теоретическое введение
Аналитические методы, используемые в химико-токсикологических исследованиях должны быть валидированы (метрологически аттестованы). Валидация метода анализа обеспечивает отсутствие систематической ошибки при его последующем использовании.
Валидация (validation), метрологическая аттестация метода анализа, - это лабораторная оценка степени пригодности аналитических методов. Валидацию проводят, используя стандартные образцы, например образцы аналитических наркотических средств и психотропных веществ (Приложение 11.1).
Процесс валидации регламентируют:
- ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) результатов измерений. Части 1-6. Изд-во стандартов. 2002 г
- ОСТ 91500.13.0001-2003 «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов» (Минздравсоцразвития).
Валидация аналитического метода предполагает его оценку по следующим показателям:
-    точность = (правильность – accuracy, trueness) + (прецизионность – precision);
-    прецизионность = (сходимость, повторяемость – repeatability) + (воспроизводимость – reproducibility);
-    специфичность - specifity, селективность- selectivity;
-    пределобнаружения - limit of detection;
-    предел количественного определения - quantitationlimit;
-    линейность - linearity.
Приведенные англоязычные названия показателей валидации необходимы для исключения неоднозначности при использовании терминов в отечественной и зарубежной литературе.
Валидация аналитического метода оформляется в виде документа, в котором должны быть представлены:
-    обоснование выбора метода с подтверждением его приемлемости для соответствующего вида испытаний, а также доказательства их преимуществ, если метод планируется для замены ранее существовавшего;
-    полное описание методики выполнения испытания, обеспечивающее его воспроизводимость специалистом, включая параметры и условия выполнения всех аналитических процедур, тесты на пригодность системы, меры предосторожности, расчетные формулы;
-    экспериментальные результаты и рассчитанные параметры валидации.
Правильностьаналитического метода характеризует близость результатов испытаний, полученных данным методом, к истинному значению. Показателем правильности метода обычно является значение систематической погрешности. Систематическая погрешность выражается как разность между математическим ожиданием результатов измерений и истинным (или в его отсутствии — принятым опорным) значением.
Прецизионностьаналитического метода характеризует степень близости независимых результатов индивидуальных испытаний, полученных в конкретных установленных условиях. Эта характеристика зависит только от случайных факторов и не связана с истинным значением измеряемой величины. Она выражается величиной стандартного отклонения. Экстремальные показатели прецизионности — сходимость (повторяемость) и воспроизводимость.
Сходимость, повторяемостьхарактеризует степень согласованности результатов измерений (испытаний), полученных одним и тем же методом на идентичных объектах испытаний, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени. Для оценки сходимости (повторяемости) результатов измерений определяют относительное стандартное отклонение.
Воспроизводимость оценивается при разных условиях
а) каждодневная воспроизводимость - тестирование проводят разные аналитики, в разные дни, на разных сериях стандартных образцов, с разными растворами стандартов, на разном оборудовании;
б) межлабораторная воспроизводимость  - тестирование проводится двумя или несколькими лабораториями при одинаковых условиях.
 Специфичность, селективность аналитического метода определяется его способностью достоверно определять токсикант в присутствии примесных соединений.
Предел обнаружения выражается минимальным содержанием определяемого вещества в образце, которое может быть обнаружено данным методом. Одним из способов определения предела обнаружения является определение концентрации, соответствующей отношению сигнал-шум, равному трем.
Предел количественной оценки— это минимальное количество определяемого вещества, которое может быть оценено количественно с приемлемой правильностью и прецизионностью. Это характеристика методов количественного определения малых содержаний веществ в образце (например, примесей или продуктов деградации). Предел количественного определения выражается как концентрация анализируемого вещества в образце (в %, ррm). При этом для шести последовательных измерений относительное стандартное отклонение не должно превышать 20%.
Линейность устанавливается на основании результатов испытаний, которые пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образце в пределах аналитической методики. Линейность результатов может быть представлена графически в виде зависимости аналитических сигналов от концентрации вещества (не менее 5). Для подтверждения линейности аналитической методики применяются следующие параметры: коэффициент регрессии, который должен быть не менее 0,995, угол наклона линии регрессии.
 
После того, как лабораторное оборудование прошло валидационные испытания, его можно использовать для определения токсичных веществ в биоматериалах и вещественных доказательствах. Получаемые при анализе результаты должны быть метрологически оценены (статистически обработаны). Их статистическая обработка заключается в расчете ряда метрологических параметров. При оптимальном объеме выборки (n≥5) определяют:
- среднее значение определяемой величины
;
- случайное отклонение i-ой варианты от среднего
;
- дисперсию V (s2), показывающую рассеяние вариант относительно среднего
;
- стандартное отклонение (или среднее квадратичное отклонение) s
s =  = ;
- стандартное отклонение среднего
- относительное стандартное отклонение
Дисперсия V, стандартное отклонение s и стандартное отклонение среднего , относительное стандартное отклонение  характеризуют воспроизводимость анализа. Чем меньше их значения, тем лучше воспроизводимость анализа.
            Далее определяют доверительный интервал среднего, т.е. интервал значений определяемой величины, в котором с заданной доверительной вероятностью Р (например, 0,95 или 0,99) находится действительное значение определяемой величины . Полуширину доверительного интервала находят по формуле: , где t P,f – коэффициент Стьюдента, зависящий от доверительной вероятности Р и числа степеней свободы f = n-1 (Приложение 11.2).
            Окончательно результат может быть представлен в виде относительной ошибки среднего результата
 
I. Примеры вопросов входного теста
 
1.      Дайте определение понятия «Валидация».
а) процедура подтверждения соответствия, посредством которой независимая от изготовителя (продавца, исполнителя) и потребителя (покупателя) организация удостоверяет в письменной форме, что методика анализа соответствует установленным требованиям;
b) процесс лабораторного изучения степери пригодности аналитических методов;
c) определение степени близости независимых результатов индивидуальных испытаний, полученных в конкретных установленных условиях;
d) процесс изучения способности аналитического метода достоверно определять токсичное вещество в биоматериале.
 
2.      Валидации подвергаются аналитические методы, используемые для:
a)      идентификации сильнодействующих лекарственных веществ;
b)      идентификации тяжелых металлов
c)      количественного определения любого ксенобиотика;
d)     количественного содержания остаточных органических растворителей в лекарственных средствах.
 
3.      Оценку метода анализа при валидации проводят по следующим характеристикам:
a)      точность;
b)      правильность;
c)      прецизионность;
d)     селективность;
e)      линейность.
 
4.      Случайные ошибки анализа:
a)      характеризуют воспроизводимость анализа;
b)      можно оценить методами математической статистики;
c)      может быть устранена.
 
5.      Систематическая ошибка:
a)      характеризует правильность результатов;
b)      это статистически значимая разность между средним  и действительным а значением содержания определяемого вещества;
c)      может быть выявлена при использовании стандартных образцов, метрологически аттестованных методов или методом добавок.
 
6.      Прецизионность включает в себя оценку:
a)      точности;
b)      повторяемости;
c)      сходимости;
d)     предела обнаружения;
e)      воспроизводимости;
 
7.      Специфичность метода анализа оценивают по:
a)      линейности;
b)      пределу обнаружения;
c)      пределу количественного определения;
d)     воспроизводимости.
 
8.      Надежность аналитического метода определяется:
a)      степенью воспроизводимости;
b)      правильностью;
c)      степенью сходимости;
d)     линейностью метода.
9.      По формуле s =  рассчитывают:
 
a)      правильность;
b)      случайную погрешность;
c)      систематическую погрешность;
d)     точность.
 
10. Укажите соответствия:
Критерий оценки качества выполняемых лабораторных исследований
Сущность критерия
  1. повторяемость;
  2. воспроизводимость;
  3. правильность;
  4. точность;
  5. предел обнаружения.
a)      степень близости результата истинному значению;
b)      минимальное содержание искомого компонента;
c)      степень близости друг к другу независимых результатов единичного анализа, полученных по одной и той же методике, на одних и тех же пробах, в одинаковых условиях и практически одновременно;
d)     степень близости друг к другу независимых результатов анализа, полученных по одной и той же методике, на одних и тех же пробах, в различных условиях;
e)      степень близости среднего значения из серии результатов единичного анализа к истинному значению.
 
 
II. Лабораторно-практическое занятие «Статистическая обработка результатов количественного анализа биоматериалов и вещественных доказательств».
 
Подготовить ответ по индивидуальной карточке заданий для участия в семинаре.
 
Образцы задач, входящих в карточки индивидуального задания:
 
1)      Описанслучай [Am. J. Forensic Med. Pathol. 17(4).- 343-346.-1996] смерти 31-летней женщины после нанесения ей незначительных телесных повреждений. Хроматографическим методом в крови погибшей были обнаружены ацетальдеид, этанол и метронидазол. В акте судебно-химического заключения было указано, что смерть наступила из-за сердечной недостаточности в связи с передозировкой метронидазола в комбинации с этанолом. Рассчитайте дисперсию V% по экспериментальным данным, полученным при определении метронидазола в крови:

 
1
2
3
4
5
6
7
X, мкг/л
420
450
425
430
438
421
440


 
2. Рассчитайте относительное стандартное отклонение результатов определения ртути в суточной моче рабочего, полученных методом атомно-абсорбционной спектрометрии с холодным паром при судебно-химическом исследовании после воздействия паров ртути в условиях производства (в норме содержание ртути в моче не должно превышать 20 мкг/л):

 
1
2
3
4
5
Х, мкг/л
93,6
95,3
92,4
90,9
94,2
 
 
 

 
3. Рассчитайте относительную ошибку среднего результата при судебно-химическом исследовании цельной крови человека, который при попытке суицида ввел внутримышечно 40 мл металлической ртути (в норме содержание ртути в крови <8 мкг/л). Результаты получены методом атомно-абсорбционной спектрометрии с холодным паром после предварительной кислотной минерализации пробы крови в тефлоновых «бомбах» в микроволновой печи:
 
1
2
3
4
5
Х, мкг/л
61,4
59,3
62,1
58,6
59,8
 
 
 
 
4. Через 18 суток после попытки суицида в моче человека был обнаружен таллий (метод атомной абсорбции с графитовой кюветой; предварительная минерализация в открытой системе кислотами-окислителями; норма таллия в моче 0,05-1,69 мкг/л):
Рассчитайте полуширину доверительного интервала среднего результата при доверительной вероятности Р=0,95.
 
1
2
3
4
5
Х, мкг/л
204,4
205,3
204,8
204,7
205,1
 
 
 
 
 
По каждой задаче сделайте вывод о воспроизводимости полученных результатов.
 
 
Литература
 
1. Материалы лекций.
2. Токсикологическая химия: Учебник для вузов / Под ред. Т.В. Плетеневой. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. – С. 182-186
3. Харитонов Ю.Я., Григорьева В.Ю. Примеры и задачи по аналитической химии.-М: ГЭОТАР-Медиа,2007.-С. 8-46
4. Арзамасцев А.П., Садчикова Н.П., Харитонов Ю.Я. Валидация аналитических методов // Фармация, 4. – 2006.- С. 8-12.
Вопросы для подготовки к семинару на тему «Методология ХТА. Изолирование».

 
Группа веществ, изолируемых из биологического материала экстракцией и сорбцией.
Общая характеристика соединений. Основы метода изолирования. Способы и методы очистки водных извлечений и экстрактов. Подгруппа «Лекарственные вещества». Токсикологическое значение. Особенности метода изолирования. Методы обнаружения и количественного определения.
Вещества кислотного характера:
1) Органические кислоты: бензойная, салициловая, ацетилсалициловая, пикриновая.
2) Барбитураты: барбитал, фенобарбитал, барбамил, этаминал-Na, бутобарбитал, гексенал, бензонал, бензобамил, циклобарбитал и др.
Вещества нейтрального характера:
1) Небарбитуровые снотворные: ноксирон, тетридин.
2) Сердечные гликозиды.
3) Многоатомные фенолы: гидрохинон, пирогаллол.
4) Полинитропроизводные: м-динитробензол, динитротолуолы, тринитротолуол.
5) Производные анилина и п-аминофенола: фенацетин, п-фенилендиамин.
Вещества основного характера:
1) Алкалоиды: производные пиридина и пиперидина (жидкие алкалоиды), тропана (атропин, кокаин и др.), хинолина (хинин), изохинолина (опийные), индола (стрихнин, бруцин, резерпин), пурина (кофеин, теобромин, теофиллин), пирролизидина (платифиллин, саррацин), ациклические (эфедрин), стероидоподобные (вератрин) и неустановленного строения (аконитин).
2) Синтетические вещества основного характера: антипирин, амидопирин - производные пиразола, промедол - производное пиперидина, новокаин и дикаин - производные аминокислот ароматического ряда, изониазид, производные фенотиазина - аминазин и др., производные бензодиазепина и т.д.
Теоретические основы изолирования
Вспомните уравнения Гендерсона-Гассельбаха для кислот и оснований!!
Изолирование «нелетучих» ядов из биологического материала основано на различной растворимости их ионизированной и молекулярной форм в воде и органических растворителях и на коэффициенте распределения молекулярной формы между водной и органической фазами.
Кр = Соргвода,        где Кр - коэффициент распределения молекулярной формы,
                                        С - концентрации вещества в водной и органической фазах.
Чем больше Кр, тем эффективнее идет экстракция.
Факторы, влияющие на эффективность изолирования «нелетучих» ядов из биоматериала
На первой стадии:
1)            Растворимость яда в используемом экстрагенте
                рН = рКα + 2(3) для кислот
                рН = рКα - 2(3) для оснований
2)            Экстрагент
-Способность легко проникать в клетки тканей.
-Высокая растворяющая способность (по отношению к яду).
-Селективность (по отношению к анализируемым соединениям).
3)            Степень измельченности объекта
На второй стадии:
1)            Растворимость яда, которая определяется степенью ионизации α и регулируется рН среды.
                рН = рКα - 2(3) для кислот
                рН = рКα + 2(3) для оснований
2)            Природа экстрагента, его объем, время и кратность экстракции.
                -Не смешиваются с водой и по плотности (r) значительно отличаются от нее.
                -Имеют низкую температуру кипения.
                -Хорошо растворяют изолируемое вещество и обеспечивают высокий коэффициент распределения его между водной и органической фазами
Уравнение степени экстракции (Е)
Е = 100∙Крр+Vaq/Vорг   (%)                        где Кр - коэффициент распределения
                                                                              Vaq – объем водной фазы
                                                                              Vорг - объем органической фазы
Изолирование подкисленным этанолом
           Настаивание измельченного объекта с этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой до рН 2-3, в течение суток.
           Упаривание объединенных спиртовых извлечений при температуре 40-50°С до густого остатка, в который по каплям добавляют абсолютный этанол для коагуляции белков.
           Упаривание фильтрата при той же температуре до густого остатка и разбавление горячей водой для удаления смолистых веществ, жиров и пигментов.